绝对定量的标准品如何制作?

说到标准品,我们先说说绝对定量:绝对定量是指在实时荧光定量 PCR 实验中,对已知量的样本进行连续稀释后扩增,生成标准曲线。然后通过与此曲线比较,定量未知样本,绝对定量可测定靶点的实际拷贝数。包括以下三个步骤:

(1) 将标准品稀释成不同浓度,作为模板进行扩增;

(2) 以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的Ct值为纵坐标绘制标准曲线;

(3) 根据未知样品的Ct值,即可在标准曲线中获得样品的拷贝数。

以上可以看出标准品之于绝对定量是非常非常重要的,那么标准品该怎样选择?

在GB/T22554-2010《基于标准样品的线性校准》中注明标准样品的组分需要与被测样品组分一致。

标准品既可以是含有目的基因的线性化质粒DNA,也可以是比目的基因扩增片段长的纯化后的PCR产物,或者基因组DNA和cDNA,但是需要作为标准品的核酸必须保证稳定并且需要精准定量。并且由于核酸提取、逆转录等实验过程可能会影响反应结果,所以需要注意标准品的实验步骤应与实验样品尽可能相同。常用标准品包括:

-DNA标准品-

纯化的PCR扩增片段或含有目的基因的克隆质粒。

优点:易制备,储存稳定;

缺点:缺少逆转录反应过程。

-RNA标准品-

目的基因的体外转录RNA。

优点:结合逆转录反应过程;

缺点:制备时间长,不稳定。

标准品的制备流程