18/132D数字PCR法慢病毒载体国际标准物质溯源性

参考试剂用于通过数字PCR（dPCR）定量慢病毒载体拷贝数。参考试剂由世界卫生组织（世界卫生组织）生物标准化专家委员会于2022年建立，由装有冷冻干燥、纯化的基因组DNA的安瓿组成，用于通过数字PCR（dPCR）（18/132d）定量慢病毒载体拷贝数，并配有用于制备参考试剂18/132d的进一步稀释液的纯化基因组DNA稀释剂（18/142）安瓿。编码为18/132d和稀释剂18/142的材料包括装有从人体细胞中提取的冷冻干燥、提纯的基因组DNA（约5µg）的安瓿。参考试剂（18/132d）由外部实验室进行测试，以证明其适合作为基于dPCR的LV积分定量标准。编码为18/132d的安瓿应在无核酸酶的水中进行重组，建议的重组体积为200µL/安瓿，以使最终DNA浓度约为25ng/µL。参考试剂（18/132d）的进一步稀释应在与参考试剂一起提供的基因组DNA稀释剂（18/142）中进行（约5µg；此安瓿也应在相同体积的200µL/安瓿无核酸酶水中重新配制，以获得相同的最终DNA浓度，约为25ng/µL）。世界卫生组织参考试剂和未知测试样品的基因组DNA的相同质量（ng），例如125ng gDNA/孔，应在测定中进行测试。建议最终用户使用提供的基因组DNA稀释剂（18/142）进行18/132d的连续稀释，以产生用于估计未知样本中LV拷贝数的基因组DNA计算标准曲线。这些材料不应用于任何其他用途。数据分析必须集中在慢病毒载体整合上。

18/132D数字PCR法慢病毒载体国际标准物质参考试剂（18/132d）和基因组DNA稀释剂（18/142）均在一项国际合作研究中进行了测试，该研究涉及来自13个国家的31个实验室和64个研究方案。指定的参考试剂（18/132d）单位基于进行dPCR方法的实验室的数据，为每安瓿6.75 log10（95%CI=6.71–6.79 log10）LV拷贝数，用于dPCR方法。基因组DNA稀释剂（18/142）被证实不存在LV整合，并且将用作基因组DNA稀释剂。

生物材料来源国：英国。参考试剂（编码18/132d）和基因组DNA稀释剂（18/142）是一批安瓿，每批安瓿含有约5µg从人类细胞系中提取的冷冻干燥和纯化的基因组DNA。使用“盐析”法提取基因组DNA，并在冷冻干燥前用5mg/mL海藻糖在Tris-EDTA缓冲液中稀释。

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